酶切反應(yīng)條件的優(yōu)化當(dāng)建立
NEB內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系時(shí)有幾個(gè)關(guān)鍵因素需要考慮。下面整理了以下有關(guān)NEB內(nèi)切酶反應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)和技巧。
標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：
限制性?xún)?nèi)切酶10units*
DNA1μg
10XNEBuffer5μl(1X)
總反應(yīng)體系50μl
溫育溫度因酶而異
溫育時(shí)間60分鐘
*足夠切割所有類(lèi)型的DNA。
省時(shí)酶切反應(yīng)體系：
限制性?xún)?nèi)切酶1μl
DNA1μg
10XNEBuffer5μl(1X)
總反應(yīng)體系50μl
溫育溫度因酶而異
溫育時(shí)間5-10分鐘*
*具有省時(shí)酶切特性的內(nèi)切酶也可以過(guò)夜反應(yīng)而沒(méi)有星號(hào)活性。
NEB內(nèi)切酶
•從冰箱取出后請(qǐng)一直置于冰上。
•酶zui后加入到反應(yīng)體系中。
•加入酶之前將反應(yīng)混合物混勻，可以用移液槍上下吹打或輕彈管壁，然后在離心機(jī)中快速離心。切忌振蕩混勻。
•一般情況下，我們推薦使用5-10單位酶量/μgDNA，基因組DNA用10-20單位酶量消化1小時(shí)。
•NEB推出一系列的高保真（HFTM）內(nèi)切酶，為建立酶切反應(yīng)體系提供了更多便利。
•如果使用RE-Mix®，請(qǐng)參考2013﹒2014商品目錄276頁(yè)的操作方法。
DNA
•避免酚、氯仿、酒精、EDTA、變性劑或過(guò)多鹽離子的污染。推薦在純化過(guò)程中多清洗幾次。
•甲基化的DNA會(huì)抑制某些酶的切割效率。
緩沖液
•使用終濃度為1X的緩沖液。
•BSA已被添加到NEB緩沖液1.1、1.2、1.3和CutSmart緩沖液中，無(wú)需額外添加BSA。
•在不需要BSA即可達(dá)到*活性的酶切反應(yīng)中如果加入BSA也不會(huì)影響酶切效果。
反應(yīng)體系
•建議在50μl反應(yīng)體系中消化1μg底物DNA。
•加入內(nèi)切酶的量應(yīng)不超過(guò)總體積的10%，以避免甘油過(guò)量引起的星號(hào)活性。
•內(nèi)切酶貯存液中的添加物（如：甘油和鹽）和底物溶液中尚存的殘余物（如：鹽、EDTA或乙醇）會(huì)導(dǎo)致小體積反應(yīng)出現(xiàn)問(wèn)題。下述為小體積反應(yīng)技術(shù)指南。
酶切反應(yīng)體系的選擇
*當(dāng)內(nèi)切酶用量小時(shí)，用推薦稀釋液稀釋后使用。
**使用10μl反應(yīng)體系時(shí)，溫育時(shí)間不要超過(guò)1小時(shí)，以防蒸發(fā)。
溫育時(shí)間
•標(biāo)準(zhǔn)體系溫育1小時(shí)，省時(shí)酶切體系溫育5-15分鐘。
•使用省時(shí)內(nèi)切酶。
•許多內(nèi)切酶都可以用更少單位的酶消化16小時(shí)。
終止反應(yīng)
若消化后的DNA不需要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作：
•用終止液終止反應(yīng)[50%甘油、50mMEDTA（pH8.0）和0.05%溴酚藍(lán)]（如NEB#B7021）。按每50μl反應(yīng)體系中加入10μl的比例進(jìn)行。
若消化后的DNA需要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作：
•用熱失活法（以確定該酶能否熱失活）。
•若該酶不能熱失活，利用商業(yè)化的離心柱或酚/氯仿抽提去除內(nèi)切酶。
貯存
•大多數(shù)內(nèi)切酶建議保存在-20℃。只有少數(shù)NEB內(nèi)切酶若貯存時(shí)間超過(guò)30天建議保存在-70℃。
•10XNEBuffer也應(yīng)保存在-20℃。
穩(wěn)定性
•NEB每4個(gè)月都會(huì)對(duì)所有的內(nèi)切酶進(jìn)行活性檢測(cè)。使用期限標(biāo)注在每管產(chǎn)品的標(biāo)簽上。
•在任何情況下，都應(yīng)盡可能的避免將酶置于高于-20℃的溫度下。
對(duì)照反應(yīng)
如果在切割底物DNA時(shí)遇到了問(wèn)題，建議加入以下對(duì)照實(shí)驗(yàn)：
•酶切對(duì)照DNA（含有多個(gè)已知內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的DNA，如LambdaDNA或腺病毒-2DNA），以檢測(cè)內(nèi)切酶的活性。
•如果對(duì)照DNA能夠被切割而實(shí)驗(yàn)中的底物DNA不能，可以將這兩種DNA混合在一起再進(jìn)行酶切，以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用的底物DNA中是否存在抑制反應(yīng)的物質(zhì)。如果確實(shí)存在某種抑制因子（通常為鹽、EDTA或酚），則混合之后對(duì)照DNA也不能被切割。
星號(hào)活性
•當(dāng)內(nèi)切酶在非zui適條件下使用時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活性。
•可以通過(guò)以下方法降低星號(hào)活性：使用高保真（HF）內(nèi)切酶、縮短溫育時(shí)間、使用省時(shí)內(nèi)切酶或者增大反應(yīng)體積。
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